Neuromodulación inalámbrica in vitro e in vivo por TRPC intrínseco

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1166 (2022) Citar este artículo

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Varios métodos de estimulación cerebral profunda magnética (DBS) se han desarrollado rápidamente en la última década para minimizar la invasividad de DBS. Sin embargo, los métodos DBS magnéticos actuales, como la estimulación magnetotérmica y magnetomecánica, requieren la sobreexpresión de canales iónicos exógenos en el sistema nervioso central (SNC). No está claro si la estimulación magnetomecánica puede modular las neuronas del SNC no transgénicas o no. Aquí, revelamos que el torque de los nanodiscos magnéticos con un campo magnético alternativo débil y lento (50 mT a 10 Hz) podría activar las neuronas a través de los canales canónicos de potencial receptor transitorio intrínseco (TRPC), que son canales iónicos mecanosensibles ampliamente expresados en el cerebro. La inmunotinción con c-fos muestra el aumento de la actividad neuronal por DBS inalámbrico con enfoque magnetomecánico in vivo. En general, esta investigación demuestra un enfoque magnetomecánico basado en nanodiscos magnéticos que se puede utilizar para la estimulación neuronal inalámbrica in vitro y DBS sin ataduras in vivo sin implantes ni manipulación genética.

La estimulación cerebral profunda (DBS) eléctrica convencional se ha utilizado para tratar trastornos neurológicos, especialmente trastornos motores como la enfermedad de Parkinson, el temblor esencial y otras enfermedades1. Sin embargo, el uso de estimulación eléctrica requiere implantaciones crónicas invasivas con electrodos en las regiones cerebrales profundas2. Para minimizar la invasividad de DBS, se desarrollaron enfoques acumulativos, incluidos enfoques de modulación neuronal óptica3, acústica4 y electromagnética5. La optogenética usaba la luz para activar las opsinas en los tipos de células diana. Pero las luces pueden dispersarse y absorberse fácilmente por los tejidos biológicos. La implantación de fibra óptica es necesaria para llevar la luz a los tejidos profundos. El enfoque acústico con ultrasonido, al igual que la sonogenética y la estimulación con ultrasonido focalizado, puede modular la actividad neuronal sin implantes de hardware. Pero las ondas de ultrasonido pueden ser dispersadas, reflejadas y distorsionadas por cráneos y huesos. Además, se requiere el montaje de sondas de ultrasonido con una ventana craneal acuosa en la estimulación neuronal acústica. Entre todos los enfoques físicos, solo los campos magnéticos pueden penetrar en el cerebro sin absorción ni dispersión6. La estimulación magnética transcraneal (TMS) es un enfoque de estimulación neuronal no invasivo mediante el uso de fuertes campos magnéticos (>1 T) para inducir corrientes eléctricas en el cerebro. Los fuertes campos magnéticos utilizados por TMS pueden causar efectos secundarios indeseables como espasmos musculares, dolor facial y otras molestias7. La aplicación clínica de TMS se limita a la estimulación cortical que no se puede utilizar para DBS. En la última década, el uso de campos magnéticos débiles para la DBS magnética inalámbrica se logró mediante el uso de enfoques de modulación neuronal basados en nanopartículas magnéticas8,9,10,11,12,13.

El calor disipado de las nanopartículas magnéticas a través de la pérdida de potencia histerética con la aplicación de campos magnéticos alternativos a radiofrecuencia (100 kHz a 1 MHz) se utilizó en magnetotermogenética9. Para manipular la actividad neuronal con estimulaciones magnetotérmicas, el canal catiónico termosensible, el receptor potencial transitorio vaniloide 1 (TRPV1) o el canal aniónico termosensible, anoctamin1, se sobreexpresaron en las neuronas diana9,10,13. Se ha demostrado DBS inalámbrico con magnetotermogenética en ratones que se mueven libremente in vivo. La DBS magnética en el núcleo subtalámico (STN) con magnetotermogenética podría rescatar los comportamientos anormales en ratones con enfermedad de Parkinson13. Recientemente, se demostró otro enfoque magnético, la estimulación magnetomecánica, tanto en el sistema nervioso periférico (SNP) como en el sistema nervioso central (SNC). En este enfoque, la fuerza mecánica del par de torsión de nanopartículas magnéticas o nanodiscos magnéticos durante campos magnéticos débiles y lentos se utilizó para estimular la actividad neuronal de forma inalámbrica. En el SNP, los canales iónicos mecanosensibles, Piezo1/2 y TRPV4, están altamente expresados en las neuronas sensoriales14. Un estudio demostró que el par de nanodiscos magnéticos de ~250 nm en un campo magnético débil y de variación lenta (<25 mT a 5 Hz) podría inducir respuestas de Ca2+ en neuronas mecanosensibles en los ganglios de la raíz dorsal primaria (GRD)11. A diferencia del SNP, el nivel de expresión de Piezo1/2 en las neuronas del SNC es muy bajo. En magnetomecanogenética, Piezo1 se sobreexpresó en las neuronas diana del cerebro. Esas neuronas que expresan Piezo1 podrían ser estimuladas por el par de nanopartículas magnéticas de 500 nm con un campo magnético de 20 mT a 0,5 Hz12. Sin embargo, tanto en la magnetotermogenética como en la magnetomecanogenética, los posibles efectos secundarios de la sobreexpresión de genes exógenos aún se desconocen. Los vectores virales para la entrega de genes en aplicaciones clínicas también plantearon problemas de seguridad15,16. Por lo tanto, en este estudio, desarrollamos un enfoque no genético para eliminar la necesidad de la entrega de genes.

El receptor potencial canónico transitorio (TRPC) es una familia de canales de cationes no selectivos que se expresa en gran medida en varias regiones del cerebro. Hay 3 subgrupos: TRPC1/4/5, TRPC2 y TRPC3/6/7. Entre ellos, los TRPC1, 5 y 6 de mamíferos son mecanosensibles y desempeñan un papel en las respuestas estimuladas por estiramiento17,18,19. TRPC juega múltiples roles funcionales en las neuronas tanto en condiciones fisiológicas como patológicas20,21,22,23, incluidos el desarrollo de las neuronas, el aprendizaje, la memoria y los comportamientos relacionados con el miedo22,24. El TRPC está implicado en diversas enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Parkinson25, la enfermedad de Huntington26 y el ictus isquémico27. En comparación con Piezo1/2, el TRPC requiere una mayor fuerza mecánica para activarse28. No está claro si la estimulación magnetomecánica puede activar la TRPC intrínseca. En este estudio, planteamos la hipótesis de que las respuestas neuronales intrínsecas mediadas por TRPC podrían desencadenarse mediante una estimulación magnetomecánica ligeramente más fuerte que la utilizada para activar el Piezo1 exógeno en estudios anteriores11,12. El cual puede ser utilizado para la modulación neuronal in vitro e in vivo (Fig. 1a). Para transducir la fuerza mecánica a las neuronas, en este estudio se utilizaron nanodiscos (MND) de magnetita (Fe3O4) descritos anteriormente11. En ausencia de campos magnéticos, los estados de vórtice de los MND tenían una mejor estabilidad coloidal en la solución. En campos magnéticos débiles a baja frecuencia, la fuerza mecánica generada por el torque de los MND puede activar los canales iónicos mecanosensibles en la membrana celular11.

un esquema de estimulación magnetomecánica mediante el uso de MND. Imágenes TEM de MND recubiertos con PMAO (b) y HND (c) con 6 % de H2O en la solución de reacción en el primer paso de la reacción. Imágenes TEM de MND recubiertos con PMAO (d) y HND (e) con 8 % de H2O en la solución de reacción en el primer paso de la reacción. f Diámetro de nanodiscos medido a partir de imágenes TEM (Todos los grupos, n = 10). g Espesor de nanodiscos medido a partir de imágenes TEM (Todos los grupos, n = 10). El análisis estadístico de diámetro y espesor se muestra en la Tabla S1-3. h Espectros XRD de MND y HND de diferentes condiciones. i El potencial zeta de los MND recubiertos con PMAO (n = 12) y HND (n = 9). p = 0,917, prueba de Mann-Whitney. Las barras de error representan la media ± la media estándar de error (sem).

Se utilizaron nanodiscos de magnetita superparamagnética (MND) como nanotransductores para estimulaciones neuronales magnéticas. Los nanodiscos de magnetita anisotrópica se sintetizaron mediante un protocolo de síntesis de dos pasos descrito anteriormente11 (Fig. S1a). En el primer paso, los nanodiscos (HND) de hematita no magnética (α-Fe2O3) se sintetizaron mediante el método solvotérmico en un reactor autoclave a 180 °C. A continuación, se prepararon los MND reduciendo los HND manteniendo los mismos tamaños. El tamaño de los HND y MND uniformes se puede ajustar mediante la concentración de H2O en la solución de la reacción del primer paso (Fig. 1b-e, S1b). Los diámetros de los HND fueron 282,8 ± 10,2 nm y 221,0 ± 4,2 nm con 6 % y 8 % (v/v) de H2O respectivamente en el primer paso de la reacción. Los diámetros de los MND fueron 280,0 ± 5,9 nm y 212,4 ± 7,0 nm cuando se usaron respectivamente H2O al 6 % y al 8 % (v/v) en la reacción del primer paso (Fig. 1f-g). Los tamaños y geometrías de HND y MND del mismo proceso de síntesis fueron similares (Fig. 1f, g, Tabla S1-3). Los espectros de difracción de rayos X (XRD) muestran que los HND del primer paso se redujeron completamente a MND (Fig. 1h). De manera similar, las curvas de magnetización muestran que los HND no se pueden magnetizar con la aplicación de un campo magnético externo (Fig. S1c). A diferencia de los HND, los MND pueden magnetizarse mediante un campo magnético externo. Los momentos magnéticos de los MND calculados a partir del resultado de VSM son 8,7 × 10−16 Am2. Por lo tanto, para examinar la función de los MND en la estimulación neuronal, se utilizaron HND no magnéticos en grupos de control negativos. A partir del cálculo en un estudio anterior, los nanodiscos magnéticos más grandes podrían generar una fuerza mecánica más grande. Por lo tanto, utilizamos nanodiscos con diámetros más grandes (> 250 nm) para la estimulación magnetomecánica en neuronas de tipo salvaje no transgénicas (Fig. 1b, c). Para funcionalizar los nanodiscos, todos los MND y HND para estimulación neuronal se recubrieron con poli(anhídrido maleico-alt-1-octadeceno) (PMAO)11. Las nanopartículas cargadas negativamente podrían promover la unión de nanodiscos a las células neuronales excitables29. El potencial zeta de los nanodiscos recubiertos con PMAO fue de −53,5 ± 3,7 mV para MND y −54,5 ± 2,3 mV para HND (Fig. 1i). Los MND recubiertos con PMAO y los HND recubiertos con PMAO se usaron para la estimulación neuronal magnetomecánica y los grupos de control en este estudio, respectivamente.

A continuación, se aplicaron MND o HND (70 μg/ml) en las neuronas cultivadas del hipocampo primario. La imagen del microscopio electrónico de barrido (SEM) muestra que tanto los MND como los HND estaban unidos a la membrana de las neuronas primarias del hipocampo (Fig. 2a, b). Con el registro de células completas, no observamos ninguna diferencia significativa del potencial de membrana en reposo entre las neuronas con y sin MND y HND cargados negativamente (Fig. S2a-d). Tampoco hubo diferencias significativas en las otras propiedades intrínsecas entre los grupos (Fig. S2e, f). Se utilizó un aparato magnético diseñado a medida para el microscopio de fluorescencia para la estimulación magnética bajo el microscopio vertical (Fig. 2c). En la simulación del método magnético de elementos finitos (FEMM), se generó un campo magnético homogéneo de 50 mT dentro del centro de la bobina diseñada a medida con una aplicación de corriente de 3 A (Fig. 2d, arriba). Lo cual es muy similar a los 50 mT medidos de la bobina real con una corriente de 2,8 A (Fig. 2d, abajo). No observamos un aumento evidente de temperatura (∆T = 0,20 ± 0,23 °C) con la aplicación continua de corriente de 3 A durante 2 min. Las actividades neuronales se midieron utilizando el indicador Ca2+, Fluo-4. Descubrimos que cuando aplicamos MND a las neuronas cultivadas primarias, una estimulación magnética con 50 mT a 10 Hz puede inducir respuestas de Ca2+ en las neuronas (Fig. 2e, g, h). Por el contrario, el campo magnético con la misma condición no puede inducir ninguna respuesta de Ca2+ en los grupos de control con aplicación de HND (Fig. 2f-h).

Imágenes SEM de MND (a) y HND (b) en la membrana de neuronas cultivadas. c Esquema del aparato magnético para microscopio de fluorescencia. a la derecha, la dimensión de la bobina hecha a medida. d Mapas de calor de campos magnéticos generados por bobina. arriba, simulación FEMM de la bobina con corriente de 3 A. abajo, el campo magnético medido dentro de la bobina con corriente continua de 3 A. Mapas de color de la intensidad de fluorescencia de las neuronas con la aplicación MND (e) o HND (f). Se aplicó un campo magnético de 50 mT a 10 Hz durante 30 s. g Promedio de trazas de respuestas de Ca2+ por estimulación de campo magnético. Línea roja, grupo MND (n = 19/3 (neuronas/muestras)); Línea negra, grupo HND (n = 13/3); Área de luz, sem h Cambio máximo de respuestas de Ca2+ en diferentes grupos (MND, n = 19/3 (neuronas/muestras); HND, n = 13/3). ***p < 0,001, prueba de Mann-Whitney. Las trazas promediadas de respuestas neuronales de Ca2+ inducidas magnéticamente que fueron estimuladas por diferentes frecuencias a 1 Hz (i, n = 46/6 (neuronas/muestras)), 5 Hz (j, n = 30/6), 10 Hz (k, n = 19/6), o 20 Hz (l, n = 18/6). En cada frecuencia, la intensidad del campo magnético se incrementó secuencialmente de 10 a 50 mT. Las áreas grises son sem Las áreas de color indican los períodos de tiempo de la estimulación magnética a 10 (azul), 20 (cian), 30 (verde), 40 (rosa) y 50 mT (naranja). m El máximo ΔF/F0 en diferentes condiciones (1 Hz, n = 46/6 (neuronas/muestras)); 5 Hz, n = 30/6; 10 Hz, n = 19/6; 20 Hz, n = 18/6. F = 9,639, p < 0,001 para intensidad de campo, F = 6,155, p < 0,001 para frecuencias; F = 1.459, p = 0.11 para interacción de frecuencias e intensidades. ANOVA de dos vías. ***p < 0,001, prueba post-hoc de Tukey. Las barras de error representan la media ± sem

Para identificar la condición óptima para la estimulación magnetomecánica con mecanosensores intrínsecos, comparamos las respuestas neuronales en los campos magnéticos con diferentes frecuencias e intensidades de campo. Los campos magnéticos alternativos de 1 a 20 Hz se utilizaron para inducir respuestas de Ca2+ en neuronas cultivadas con MND (70 μg/ml). A diferentes frecuencias, las intensidades del campo magnético aumentaron secuencialmente de 10 mT a 50 mT (Fig. 2i-l, S3). Encontramos que las respuestas de Ca2+ con simulación de 50 mT fueron significativamente mayores que otras intensidades de campo magnético de 10 a 40 mT (Fig. 2m). Las respuestas de Ca2+ a 5 a 20 Hz fueron significativamente mayores que las respuestas a 1 Hz. Estos resultados indican que el torque de los MND fue lo suficientemente grande como para desencadenar actividad neuronal con estimulación magnética de 50 mT.

Cuando estimulamos las neuronas a 50 mT con diferentes frecuencias (Fig. 3a-d), encontramos que las estimulaciones de 10 y 20 Hz inducían respuestas de Ca2+ más grandes que las estimulaciones de 1 y 5 Hz (Fig. 3e). La estimulación de 10 Hz podría activar más población celular que otras condiciones (Fig. 3f). Por el contrario, la estimulación magnética con la aplicación de HND no puede inducir ninguna respuesta en las neuronas en todas las condiciones (Fig. S4a). Estos resultados indican que 50 mT a 10 Hz fue la condición óptima para activar neuronas con estimulación magnetomecánica. Además, cuando aplicamos la estimulación magnética repetidamente durante 4 veces, observamos múltiples respuestas de Ca2+ en neuronas cultivadas en todas las frecuencias (Fig. 3a-d, S4). Después de estimulación magnética repetida 4 veces, la viabilidad celular se probó con yoduro de propidio, una pequeña molécula fluorescente que solo puede penetrar en la membrana celular de las células muertas pero no en las células vivas30. No observamos ninguna muerte celular después de la estimulación a diferentes frecuencias en las neuronas tratadas con MND o HND. (Fig. 3g, h).

Estimulaciones múltiples con 50 mT a 1 Hz (a, n = 32/6 (neuronas/muestras)), 5 Hz (b, n = 51/6), 10 Hz (c, n = 52/6) o 20 Hz (d, n = 34/6). Arriba, mapa de calor de las respuestas de Ca2+ en neuronas individuales. Las celdas debajo de las líneas discontinuas blancas se activaron durante las estimulaciones. abajo, las trazas promediadas del cambio de fluorescencia. Las áreas de color naranja claro indican los períodos de tiempo de la estimulación magnética. Línea roja, grupo MND. Línea negra, grupo HND. Área rosa y gris, sem e El cambio máximo de fluorescencia a diferentes frecuencias (1 Hz, n = 32/6 (neuronas/muestras); 5 Hz, n = 51/6; 10 Hz n = 52/6; 20 Hz, n = 34/6). F = 1,050, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. f La tasa de actividad celular de cada muestra de cultivo a diferentes frecuencias (Todos los grupos, n = 6). F = 8,208, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. *p < 0,05, ***p < 0,001, prueba post-hoc de Dunn. g Tratamientos con PI en neuronas con MND tras estimulación magnetomecánica a 10 Hz. verde, fluo-4; Rojo, IP. h Cuantificación del ensayo vivo-muerto con estimulaciones a diferentes frecuencias (Todos los grupos, n = 6). F = 0,003, p = 0,995 para frecuencia; F = 0,003, p = 0,862 por tipo de nanodiscos; F = 0,022, p = 0,995 para interacción entre frecuencias y nanodiscos, ANOVA de dos vías. Las barras de error representan la media ± sem

Hay varios canales catiónicos de detección mecánica expresados en las células de mamífero. incluyendo Piezo1/2, TRPC, TRPV4, ASIC331,32. Entre ellos, TRPC y TRPV4 se reportan en el CNS31. Por el contrario, Piezo1/2 y ASIC3 se expresan principalmente en el PNS32. Para investigar el mecanismo de las respuestas mediadas por MND, se utilizó un enfoque farmacológico para diseccionar los canales iónicos que están involucrados en las respuestas estimuladas magnéticamente en las neuronas del hipocampo. En las subfamilias TRPC, TRPC1, 5 y 6 se informan como canales catiónicos mecanosensibles17,18. Encontramos que un bloqueador específico para las subfamilias TPRC, SKF-96365 (50 μM), eliminó las respuestas de Ca2+ inducidas magnetomecánicamente (Fig. 4a, e, f, S5a, b). Además, también se usaron otros bloqueadores de TRPC no específicos para examinar la contribución de TRPC, incluidos GsMTx4, d-GsMTx4 (5 μM) y borato de 2-aminoetoxidifenilo (2-APB). GsMTx4 y d-GsMTx4 son antagonistas de Piezo1 y Piezo2, respectivamente. También son antagonistas de TRPC1,5 y 619. 2-APB es antagonista de TRPC y agonista de TRPV1-3, pero insensible a TRPV433. Similar a SKF-96365, todos los bloqueadores de TRPC, incluidos GsMTx4 (5 μM), d-GsMTx4 (5 μM) y 2-APB (100 μM), pudieron eliminar las respuestas inducidas magnetomecánicamente en las neuronas del hipocampo (Fig. 4b–f, S5a, b). Estos resultados indican que TRPC intrínseco en las neuronas del hipocampo juega un papel fundamental en las estimulaciones magnetomecánicas.

Las respuestas de Ca2+ por estimulación magnetomecánica múltiple con aplicación de baño de SKF-96365 a 50 μM (a, n = 26/6 (neuronas/muestras)), GsMTx4 a 5 μM (b, n = 19/6), d-GsMTx4 a 5 μM (c, n = 19/6) y 2-APB a 100 μM (d, n = 36/6). Los estímulos magnéticos son de 50 mT a 10 Hz durante 30 s. Los intervalos entre estimulaciones son de 60 s. arriba, mapa de calor de las respuestas de las células individuales. Las celdas debajo de las líneas discontinuas blancas se activaron durante las estimulaciones. abajo, cambios de fluorescencia promediados. Las áreas de color naranja claro indican los períodos de tiempo de la estimulación magnética. Las áreas grises son sem e Cambios máximos de fluorescencia de neuronas tratadas con MND con diferentes bloqueadores TRPC en la primera estimulación magnética (Control, n = 52/6 (neuronas/muestras); SKF-96365, n = 26/6; GsMTx4, n = 19/6; d-GsMTx4, n = 19/6; 2-APB, n = 36/6). F = 146,799, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. f La tasa de actividad celular de las neuronas tratadas con MND con diferentes bloqueadores TRPC en la primera estimulación magnética (Todos los grupos, n = 6). F = 29,017, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. **p < 0,01, ***p < 0,001, en comparación con el grupo control; Prueba post-hoc de Dunn. Las barras de error representan la media ± sem

A continuación, se investigó el papel de TRPV4, otro canal iónico mecanosensible, en la estimulación magnetomecánica en las neuronas del hipocampo mediante la aplicación del bloqueador específico de TRPV4, HC-06704711. Descubrimos que HC-067047 (1 μM) no podía modular las respuestas mediadas por MND (Fig. 5a, f, g, S5c, d). Indica que las respuestas estimuladas magnéticamente no fueron mediadas por TRPV4. El bloqueador del canal de sodio dependiente de voltaje (VGSC), tetrodotoxina (TTX; 100 nM), se utilizó para investigar si los potenciales de acción estaban involucrados en las respuestas de Ca2+ inducidas magnetomecánicamente. Las respuestas de Ca2+ inducidas por la primera estimulación y las actividades celulares casi se eliminan con la aplicación de TTX (Fig. 5b, f, g). Este resultado indica que la activación de TRPC estimulada magnetomecánica podría inducir potenciales de acción en las neuronas. Curiosamente, los cambios máximos de fluorescencia y la relación de actividad celular de la estimulación múltiple se redujeron significativamente pero no se eliminaron por completo mediante la aplicación de TTX (Fig. S5c, d). Estas respuestas de Ca2+ independientes de TTX podrían ser aportadas por otros canales de Ca2+ independientes del potencial de acción. TRPC se conoce como un canal iónico catiónico no específico con permeabilidad al Ca2+. Las respuestas de Ca2+ independientes de TTX pueden ser aportadas por TRPC solo o por otros canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCC). Entre todos los VGCC, el VGCC de tipo T y el CaV1.3 del VGCC de tipo L son canales iónicos activados de umbral bajo. Para investigar si los VGCC están involucrados en las respuestas estimuladas magnetomecánicas, se aplicaron antagonistas de VGCC de tipo L y tipo T durante múltiples estimulaciones magnetomecánicas. La nifedipina y el mibefradil se denominan comúnmente antagonistas específicos de VGCC de tipo L y antagonistas específicos de VGCC de tipo T, respectivamente. Sin embargo, la evidencia acumulada muestra que son antagonistas no específicos que pueden bloquear tanto el VGCC34 de tipo L como el de tipo T. Al usar nifedipina (10 μM)35, casi no hubo respuestas de Ca2+ con múltiples estimulaciones magnéticas (Fig. 5c, f, g, S5c, d). De manera similar, con la aplicación de mibefradil (3 μM)36, las respuestas de Ca2+ por estimulación magnética múltiple se redujeron significativamente (Fig. 5d, f, g, S5c, d). Estos resultados indican que la activación de TRPC inducida magnetomecánicamente podría desencadenar VGCC. Las respuestas de Ca2+ independientes de TTX podrían no ser contribuidas por la entrada de Ca2+ a través de TRPC solo. Finalmente, con una solución extracelular libre de Ca2+, se eliminaron todas las respuestas de Ca2+ inducidas magnetomecánicamente (Fig. 5e-g, S5c, d). Estos resultados indican que estas respuestas de Ca2+ fueron aportadas por la entrada de Ca2+ desde la solución externa (Fig. 5h). En general, a partir del estudio farmacológico, encontramos que el torque de MND generado por un campo magnético alternativo puede inducir la entrada de Ca2+ desde una solución externa. Los cuales fueron causados principalmente por VGCC y potenciales de acción en neuronas cultivadas. Los experimentos SKF-96365, GsMTx4, d-GsMTx4 muestran que estas respuestas estimuladas magnetomecánicas fueron mediadas principalmente por TRPC intrínseco (Fig. 4a-f, S5a, b).

Las respuestas de Ca2+ por estimulación magnetomecánica múltiple con aplicación de baño de HC-067047 a 1 μM (a, n = 38/6 (neuronas/muestras)), TTX a 100 nM (b, n = 44/6), Nifedipino a 10 μM (c, n = 107/6), mibefradil a 3 μM (d, n = 50/7) y solución libre de Ca2+ (e, n = 79/8). Los estímulos magnéticos son de 50 mT a 10 Hz durante 30 s. Los intervalos entre estimulaciones son de 60 s. arriba, mapa de calor de las respuestas de las células individuales. Las celdas debajo de las líneas discontinuas blancas se activaron durante las estimulaciones. abajo, cambios de fluorescencia promediados. Las áreas de color naranja claro indican los períodos de tiempo de la estimulación magnética. Las áreas grises son sem f La máxima fluorescencia cambia en la primera estimulación magnética (Control, n = 52/6 (neuronas/muestras); HC-067047, n = 38/6; TTX, n = 44/6; Nifedipina, n = 107/6; mibefradil, n = 50/7; libre de Ca2+, n = 79/8). F = 135,911, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. g La tasa de actividad celular en la primera estimulación magnética (Control, n = 6; HC-067047, n = 6; TTX, n = 6; Nifedipina, n = 6; Mibefradil, n = 7; libre de Ca2+, n = 8 ). F = 30,674, p < 0,001, prueba de Kruskal-Wallis. h Esquema del mecanismo de las respuestas mediadas por MND. **p < 0,01, ***p < 0,001, en comparación con el grupo control; ##p < 0,01, ###p < 0,001, en comparación con el grupo HC-067047; Prueba post-hoc de Dunn. Las barras de error representan la media ± sem

El núcleo subtalámico (STN) es el objetivo clínico de la DBS convencional con estimulación eléctrica para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Parkinson37. Mediante el uso de inmunohistoquímica, observamos que todos los TRPC mecanosensibles, incluidos TRPC1, 5 y 6, se expresaron en el STN de ratones (Fig. 6a-c). Estos resultados son similares a un informe anterior de expresión de TRPC en STN de ratas38. Para investigar la modulación neuronal magnetomecánica para DBS en STN in vivo, se inyectaron unilateralmente nanodiscos (2 μl de 1 mg/ml) en STN de ratones (Fig. 7a). La coordenada de inyección se confirmó mediante el uso de MND marcados con fluorescencia (Fig. S6a, b). Después de la inyección, los MND marcados con fluorescencia no se degradaron ni metabolizaron durante al menos 5 días (Fig. S6c, d). Para la estimulación neuronal inalámbrica, se inyectaron MND recubiertos con PMAO y HND sin fluorescencia en la misma coordenada en STN. De 5 a 7 días después de la inyección, los ratones inyectados con nanodiscos se colocaron en un gran aparato magnético diseñado a medida con 20 cm de diámetro interno y 25 cm de altura (Fig. 7b). Este aparato magnético constaba de 4 bobinas redondas (20 cm de diámetro interior, 28 de diámetro exterior y 5 cm de altura) controladas por 4 conjuntos de controladores y fuentes de alimentación. La simulación FEMM demostró que el campo magnético en el centro de la bobina con una corriente de 10 A es de 50 mT (Fig. 7c). El campo magnético medido desde el centro de la bobina hecha a la medida es de 50 mT con una aplicación de corriente de 10 A (Fig. 7d). La temperatura de la bobina aumentó menos de 1 °C cuando se aplicó una corriente de 10 A durante 2 min (∆T = 0,70 ± 0,15 °C en la pared; ∆T = 0,83 ± 0,14 °C en el centro). Los ratones despiertos fueron estimulados por el campo magnético con 50 mT a 10 Hz con un ciclo de 30 s encendido-30 s apagado durante 10 min (Fig. 7a, b). Descubrimos que las expresiones del gen temprano inmediato, c-fos, en STN inyectados con MND eran significativamente más grandes que las STN contralaterales (Fig. 7e-g). Por el contrario, no hubo diferencias entre las expresiones de c-fos de STN ipsilateral y contralateral de ratones inyectados con HND (Fig. 7h, S7a-b). Las proporciones ipsilateral / contralateral de las expresiones de c-fos en STN de ratones inyectados con MND también fueron significativamente mayores que los grupos inyectados con HND (Fig. 7i). El núcleo entopeduncular (EP) es una de las neuronas que proyectan glutamatérgicas aguas abajo de STN en ratones. Y es homólogo al Globus Pallidus interno (GPi) en humanos. Similar a STN, las expresiones de c-fos en el EP ipsilateral de ratones inyectados con MND fueron significativamente más que en el EP contralateral (Fig. 7j, S7c, d). Pero en ratones inyectados con HND, no hubo un aumento de la expresión de c-fos en EP (Fig. 7k, S7e, f). Las proporciones ipsilateral/contralateral de las expresiones de c-fos en EP de ratones inyectados con MND también fueron significativamente mayores que las de los grupos inyectados con HND (Fig. 7l). En estudios previos, cuando se estimula unilateralmente STN de ratones sanos de tipo salvaje sin enfermedades de Parkinson, los resultados del comportamiento de rotación son controvertidos. Aquí, no observamos comportamientos de rotación obvios en ratones despiertos con estimulaciones magnéticas inalámbricas en estas condiciones (Fig. S8). Los resultados de la tinción de c-fos muestran que al usar el enfoque magnetomecánico con MND, pudimos modular de forma inalámbrica el circuito neuronal en la región profunda del cerebro in vivo.

a Inmunostinción de NeuN (rojo), TRPC1 (verde), DAPI (azul) e imagen fusionada en STN. Recuadro, imagen fusionada ampliada de una neurona. b Inmunotinción de NeuN (rojo), TRPC5 (verde), DAPI (azul) e imagen fusionada en STN. Recuadro, imagen fusionada ampliada de una neurona. c Inmunotinción de NeuN (rojo), TRPC6 (verde), DAPI (azul) e imagen fusionada en STN. Recuadro, imagen fusionada ampliada de una neurona.

un esquema de estimulación magnetomecánica en STN in vivo. Los nanodiscos se inyectaron unilateralmente en STN. abajo, Cronología de inyección estereotáxica, estimulación magnética y tinción de c-fos b Esquema del aparato de estimulación magnética inalámbrica para estimulación magnetomecánica in vivo. abajo, Línea de tiempo para estimulación magnética. c Simulación FEMM del aparato magnético in vivo con corriente de 10 A. La línea negra indica la cámara del cilindro para ratones. d La medición del campo magnético a partir de la línea discontinua blanca indica la región en c. Inmunotinción de NeuN (rojo), c-fos (verde), DAPI (azul) e imagen combinada de STN ipsilateral (e) y STN contralateral (f) de ratones inyectados con MND. g c-fos/NeuN de STN en ratones inyectados con MND (n = 9). h c-fos/NeuN de STN en ratones inyectados con HND (n = 7). i La diferencia de c-fos/NeuN entre STN ipsilateral y contralateral en ratones inyectados con nanodiscos. j c-fos/NeuN de EP en ratones inyectados con MND (n = 9). k c-fos/NeuN de EP en ratones inyectados con HND (n = 7). l La diferencia de c-fos/NeuN entre EP ipsilateral y contralateral en ratones inyectados con nanodiscos. **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, sin significación. Prueba de rango con signo de Wilcoxon para datos pareados en (g), (h), (j) y (k). Prueba de Mann-Whitney para datos no apareados en iy l. Las barras de error representan la media ± sem

En conclusión, encontramos que cuando se aplicaron campos magnéticos alternativos débiles y lentos (50 mT a 10 Hz), la fuerza mecánica generada por los nanodiscos magnéticos indujo la actividad de las neuronas de tipo salvaje sin sobreexpresar genes exógenos. Revelamos que estas respuestas magnetomecánicas fueron mediadas principalmente por el canal catiónico mecanosensible intrínseco, TRPC. Finalmente, las actividades de las regiones profundas del cerebro aumentaron mediante estimulación magnetomecánica mediada por MND en ratones despiertos in vivo. Estudios recientes de estimulación magnetomecánica en DRG que expresa Piezo1 o sobreexpresión de Piezo1 en SNC solo requieren <23 mT a 1 ~ 5 Hz. De acuerdo con informes anteriores, no observamos respuestas obvias con campos magnéticos a <40 mT en neuronas sin sobreexpresión de Piezo1/2 o TRPV4 (Fig. 2i-m). La intensidad del campo magnético para inducir la actividad TRPC en nuestro estudio es mayor (50 mT) que en investigaciones anteriores. Lo cual está de acuerdo con el informe anterior de que TRPC requiere una fuerza mecánica más fuerte que Piezo128. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que TRPC pueda ser activado por estimulación mecánica indirectamente39 cuando aplicamos estimulación magnetomecánica con MND.

Los MND y HND en este estudio se funcionalizaron con PMAO y portaban cargas superficiales negativas (Fig. 1i). Estudios previos muestran que las nanopartículas cargadas negativamente pueden facilitar la unión de la partícula en la membrana neuronal excitable pero no en la membrana glial no excitable11,29. Por el contrario, la nanopartícula neutra o cargada positivamente no puede adherirse a las membranas neuronales29. Aunque las nanopartículas cargadas negativamente en la superficie de la membrana neuronal podrían aumentar la excitabilidad29, no observamos un aumento significativo del potencial de reposo de la membrana ni de la actividad neuronal tanto in vitro como in vivo. Primero, no hay respuestas de Ca2+ en neuronas hipocampales cultivadas con HND cargados negativamente (Fig. 2e-h). Con el registro de células completas, los potenciales de membrana en reposo de las neuronas tratadas con MND y HND no fueron significativamente más altos que los grupos de control sin nanodiscos (Fig. S2a-c). Finalmente, en la inmunotinción de c-fos, las actividades neuronales in vivo en el STN y su EP aguas abajo de ratones inyectados con HND unilaterales no tuvieron diferencias entre el hemisferio ipsilateral y contralateral (Fig. 7h, k). No obstante, será necesaria una mayor modificación de la superficie de los nanodiscos para aumentar la unión específica de los nanodiscos a los canales TRPC objetivo oa las neuronas objetivo mediante la modificación de la superficie de los nanodiscos.

La mayoría de los métodos DBS sin ataduras desarrollados recientemente, que incluyen optogenética, quimiogenética, sonogenética y magnetogenética, utilizan herramientas genéticas para sobreexpresar genes exógenos en las regiones cerebrales objetivo. Sin embargo, las barreras regulatorias de los métodos genéticos que se utilizan en esos métodos limitan las aplicaciones traslacionales de esos enfoques DBS en pacientes humanos. El enfoque DBS magnetomecánico demostrado aquí es un enfoque libre de transgenes que no tiene las preocupaciones de seguridad del uso de vectores virales para la administración de genes. Este estudio no solo revela la activación de la TRPC intrínseca por estimulación magnetomecánica, sino que también revela que la activación de la TRPC intrínseca inducida por la fuerza mecánica podría desencadenar potenciales de acción y activar el VGCC en las neuronas (Figs. 4, 5). Con TTX, las respuestas inducidas por MND se redujeron significativamente. E indica que los MND pueden desencadenar potenciales de acción en las neuronas. Curiosamente, quedaron respuestas de Ca2+ independientes de TTX cuando las neuronas fueron estimuladas por estimulación magnetomecánica múltiple. Lo que podría reclutar más canales iónicos permeables a Ca2+. Los VGCC de umbral bajo, incluidos los VGCC de tipo T y CaV1.3 de los VGCC de tipo L, se expresan en gran medida en el soma y las dendritas de las neuronas del hipocampo40,41. Mediante el uso de bloqueadores de VGCC, encontramos que estas respuestas restantes de Ca2+ inducidas magnetomecánicamente fueron contribuidas por la activación de VGCC tipo T y tipo L. Sin embargo, no observamos una entrada obvia de Ca2+ a través de TRPC. Aunque las familias TRPC son canales catiónicos con permeabilidad al calcio. La permeabilidad al Ca2+ depende de la composición de subunidades del heterómero TRPC. La permeabilidad al Ca2+ del TRPC heteromérico, como TRPC1/5 y TRPC1/6, puede reducirse mediante la subunidad TRPC142,43. Esas TRPC heteroméricas con subunidades TRPC1, 5 y 6 se expresan altamente en el hipocampo y STN. Se requiere más investigación para comprender qué composiciones de subunidades TRPC están relacionadas con la estimulación magnetomecánica. La comprensión de la expresión de las subunidades TRPC en las regiones cerebrales objetivo y los tipos de células objetivo también es crucial para futuras aplicaciones.

En las enfermedades de Parkinson, DBS en STN puede rescatar los comportamientos anormales1. Sin embargo, en ratones WT sanos, la relación entre el comportamiento animal y DBS en STN no está clara. Un estudio muestra que la activación de STN por optogenética puede desencadenar la rotación ipsilateral en ratones WT44. Por el contrario, otro estudio muestra que estimular STN con magnetotermogenética aumenta la rotación contralateral en ratones WT13. Esos estudios demuestran resultados muy controvertidos de DBS en STN en ratones sin enfermedad de Parkinson. La diferencia de estos controvertidos hallazgos podría estar relacionada con los métodos de neuromodulación y las intensidades de estimulación. En este estudio, el comportamiento de rotación de los ratones inyectados con MND no se modifica por DBS magnetomecánica mediada por MND en STN en ratones despiertos. Sin embargo, con la inmunotinción de c-fos, encontramos el aumento de la actividad neuronal en los ratones WT con DBS magnetomecánico inalámbrico. Nuestra investigación demuestra una prueba de concepto para la estimulación inalámbrica de la actividad neuronal in vivo. Se requiere más investigación para optimizar los parámetros de las estimulaciones magnetomecánicas in vivo. La regulación de los TRPC se ha propuesto previamente para el tratamiento de las enfermedades de Parkinson25 y el ictus isquémico27. Desafortunadamente, los roles funcionales de los TRPC en la mayoría de las regiones del cerebro no se han caracterizado bien. Las diferencias de los roles funcionales de TRPC en varias regiones del cerebro y tipos de células deben considerarse para futuras aplicaciones. Será necesario realizar más estudios traslacionales para descubrir la aplicación potencial de la estimulación magnetomecánica en las enfermedades de Parkinson y otras enfermedades neurológicas.

Además de los enfoques de neuromodulación basados en la genética, algunos dispositivos de DBS en miniatura alimentados de forma inalámbrica y libres de transgenes aún requieren implantes de hardware a escala milimétrica o centimétrica en las regiones profundas del cerebro45,46. En la modulación neuronal libre de transgenes a nanoescala, un estudio muestra que la estimulación magnética con un campo magnético de 200 mT de CC y un campo magnético de 6 mT de CA a 140 Hz puede activar nanopartículas piezoeléctricas de cobalto, ferrita y titanato de bario para DBS inalámbrica en ratones que se mueven libremente in vivo47. En comparación, el DBS magnetomecánico en este estudio solo requiere el campo magnético débil con 50 mT a muy baja frecuencia (10 Hz). Por lo tanto, el aparato magnético para generar campos magnéticos homogéneos en el rango de estimulación magnetomecánica es escalable a volúmenes mayores. La bobina hecha a medida para experimentos in vitro e in vivo en este estudio tenía un diámetro interior de 3,5 cm y 20 cm, respectivamente (Figs. 2c, 7b). Se puede incorporar a la mayoría de los sistemas de microscopio y aparatos de comportamiento animal. La característica escalable de este enfoque es ideal para futuras aplicaciones en modelos animales o humanos más grandes. Además, las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro ya están clínicamente aprobadas como agentes de contraste en imágenes por resonancia magnética (IRM)6. Los nanodiscos magnéticos de óxido de hierro de este estudio tienen una química similar a las nanopartículas clínicamente aprobadas. Por lo tanto, este trabajo es una importante prueba de concepto en DBS remoto libre de transgenes con estimulación magnetomecánica, que se muestra prometedora para el desarrollo de futuras aplicaciones traslacionales para pacientes humanos.

El proceso de síntesis de los nanodiscos sigue el protocolo descrito en el estudio anterior11. El proceso de síntesis consta de dos pasos. En primer lugar, se sintetizaron nanodiscos de hematita mezclando 10 ml de etanol al 99,5 %, 0,6 ml de ddH2O (o 0,8 ml de ddH2O para nanodiscos más pequeños), 0,8 g de acetato de sodio anhidro (Sigma-Aldrich) y 0,273 g de FeCl3·6H2O (Sigma-Aldrich) . Después de homogeneizar la mezcla mediante agitación, la mezcla se transfirió y se selló en un recipiente de acero revestido de teflón. El recipiente se calentó en el horno a 180 °C durante 18 h. Los nanodiscos de hematites se lavaron dos veces con ddH2O. Luego, los nanodiscos se lavaron dos veces con etanol. Los nanodiscos se secaron en un desecador al vacío. Los nanodiscos de hematita se convirtieron posteriormente en nanodiscos de magnetita o se utilizaron para experimentos de control. Para la reducción, se mezclaron nanodiscos de hematites de 1 mg con 20 ml de trioctilamina (Acros Organics) y 1 g de ácido oleico (Sigma-Aldrich). La mezcla se colocó en un matraz de tres bocas conectado a una línea Schlenk para calentar a 370 °C durante 25 min en una atmósfera de H2 (5% con 95% Argon, Chiah Lung) y N2 (99,9%, Chiah Lung). Durante la reducción, los nanodiscos de hematita roja se volvieron gris oscuro. Después de enfriarse, los discos se lavaron con hexano (Alfa Aesar). Luego, los nanodiscos de magnetita se dispersaron en cloroformo (JT Baker) y se almacenaron en un vial de vidrio a 4 °C.

Tanto MND como HND están funcionalizados con recubrimiento de PMAO. Antes del recubrimiento con PMAO, los nanodiscos en cloroformo se secaron en un desecador al vacío. Primero, se disolvieron 10 mg de PMAO de 30.000 mw (419117, Sigma-Aldrich) en 1 ml de cloroformo. Se añadieron 1 mg de polvo seco de MND o HND al cloroformo que contenía PMAO. La mezcla se sonicó durante 1 h hasta que los nanodiscos quedaron bien suspendidos. A continuación, los nanodiscos recubiertos con PMAO se secaron en un desecador al vacío durante la noche. Los nanodiscos secos se añadieron al tampón TAE (Tris-acetato-EDTA, Biomate) con una concentración del 25% (p/v). La mezcla se sonicó a 80 °C durante 3 h. Después de la sonicación, se sedimentó utilizando una microcentrífuga durante 10 min a 8500 rpm. Se eliminó el sobrenadante y se rellenó con ddH2O. Repitió los procesos desde la sonicación del pozo hasta la recarga de ddH2O tres veces. Para visualizar los nanodiscos en los cortes de cerebro, se prepararon MND recubiertos con PMAO marcados con fluorescencia mezclando 200 μl de neutravidina (Thermo Scientific) con 200 μl de colorante Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific) durante dos horas. Luego se agregaron 10 mg de MND a la mezcla de neutravidina y tinte durante dos horas.

Los nanodiscos en cloroformo se secaron en un desecador al vacío y luego se disolvieron en ddH2O. Los nanodiscos acuosos se colocaron en una rejilla de cobre (Ted Pella Inc.) y se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para visualizar la morfología de los discos. TEM fue realizado con HT7800 (Hitachi) por el laboratorio central de microscopía en el Hospital Memorial Chang Gung (CGMH). El diámetro y el grosor de los nanodiscos se midieron mediante ImageJ a partir de una imagen TEM, cada nanodisco hexagonal se dibujó en tres diagonales y se eligió la distancia más larga como una medida de diámetro de nanodisco. Los polvos de nanodiscos se detectaron mediante difracción de rayos X (XRD) para confirmar la estructura de los materiales. XRD se realizó con XtaLAB Synergy DW (Rigaku) por el Centro de Instrumentación de la Universidad Nacional Tsing Hua (NTHU). Se mezcló hematita o magnetita con grasa N (Apiezon) y se recolectó en MicroMeshesTM (MiTeGen) acoplado a un detector de rayos X de conteo de fotones híbrido curvo HyPix-Arc de 150° con radiación Mo Kα monocromática con grafito (λ = 0,71073 Å) a 100 K Para estudiar la magnetización de saturación (Ms) de los nanodiscos, se utilizó un magnetómetro de muestra vibrante para medir las curvas de histéresis en el rango de ± 9 kOe. Los momentos magnéticos de los nanodiscos se midieron con MPMS SQUID Vibrating Sample Magnetometer (VSM; Quantum Design) por el Core Facility Center de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU). Además, se utilizó un espectrómetro de emisión óptica de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES) Agilent 725 para cuantificar la concentración de elementos de hierro para el cálculo del momento magnético que realizó el Centro de Instrumentación de NTHU. Para el cálculo del momento magnético, seguimos la fórmula mencionada en el estudio anterior11:

μ es el momento magnético. V es el volumen de nanodiscos, que se midió a partir de TEM. ρ es la densidad de la magnetita (Fe3O4)11. Ms es la magnetización de saturación que se mide desde VSM. El momento magnético de los MND es:

Se utilizaron nanodiscos recubiertos con PMAO disueltos en ddH2O para detectar propiedades potenciales. El potencial zeta se midió mediante dispersión de luz electroforética con el analizador de partículas DelsaTM Nano C (Beckman Coulter). Se cargaron 3,5 μl de nanodiscos con recubrimiento de PMAO de 20 mg/ml en neuronas del hipocampo a los 7 días in vitro (DIV) durante 15 min para unir los nanodiscos a las membranas celulares. A continuación, utilice PBS 1x (Gibco) para lavar tres veces con el tampón de fijación fabricado por CGMH (glutaraldehído al 3 %, paraformaldehído al 2 % en tampón de cacodilato 0,1 M). Las muestras fijas se almacenaron en un congelador a 4 °C hasta que se usó microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) para registrar los nanodiscos que se adhieren a las neuronas. FE-SEM se realizó con SU8220 (Hitachi) por el laboratorio central de microscopía en CGMH. FE-SEM se utilizó para registrar los nanodiscos que se adhieren a las neuronas con un aumento de 2000x y las características de la superficie de los nanodiscos con un aumento de 30,000x.

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung (NYCU). Todas las ratas Sprague-Dawley preñadas se adquirieron de LASCO. Las crías de ratas Sprague-Dawley en el período posnatal (<3 días) se usaron para el cultivo primario del hipocampo. Los hipocampos se extrajeron en solución de disección fría (NaCl 160 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 4 mM, HEPES 5 mM, glucosa 5,5 mM, el pH se ajustó a 7,4 con NaOH). Después de la extracción, se mezclaron los hipocampos de 2 a 3 crías y se transfirieron a una solución de digestión precalentada (L-cisteína 1 mM, EDTA 0,5 mM, CaCl2 1 mM, NaOH 1,5 mM y 10 unidades/ml de papaína (76220, Sigma-Aldrich)) . La mezcla se incubó a 37 °C durante 25 min. La papaína se inactivó eliminando la solución de digestión e incubando los tejidos en soluciones de inactivación (albúmina bovina al 0,25 % y inhibidor de tripsina al 0,25 %), D-glucosa al 0,4 % y suero bovino fetal al 5 % (6140079, Gibco) en medio mínimo esencial (MEM). con sales de Earle sin L-glutamina; 11090-081, Gibco) a 37 °C durante 2 min. Después de retirar la solución de inactivación, los tejidos se trituraron en medio de suero (D-glucosa al 0,4 % y suero bovino fetal al 5 % en MEM con sales de Earle sin L-glutamina) con pipetas de vidrio pulido al fuego (111096, Kimble). Las células disociadas se filtraron con un escurridor de células (93070, SPL) y se incubaron en el medio de suero a 37 °C antes de la siembra. Después del recuento, las células se sembraron en cubreobjetos de 12 mm recubiertos con matrigel (354234, Corning) en placas de 24 pocillos con ~110.000 células por pocillo. Las células del hipocampo se cultivaron en medio neurobasal (10888-022, Gibco) con suplemento B27 (17504-044, Gibco) y GlutaMAX (35050-061, Gibco). El tercer día in vitro (DIV) se añadieron 20 μl de inhibidor mitótico (5-fluoro-2′-desoxiuridina, Sigma; 4 μM en medio neurobasal) para inhibir las células gliales. Todas las imágenes y la estimulación se realizan en DIV 5-14.

Las neuronas del hipocampo cultivadas primarias en DIV 7-14 se usaron para el registro electrofisiológico de pinza de parche. Los registros de células completas se obtuvieron usando MultiClamp 700B (Molecular Devices, LLC, EE. UU.) bajo un microscopio vertical (Scientifica, EN). Los datos se filtraron a 5 kHz y se muestrearon a 10 kHz con una interfaz Digidata 1550B (Molecular Devices) controlada por el software Clampex 11.1 (Molecular Devices) y se analizaron con Clampfit 11.2 (Molecular Devices). Los registros se realizaron a temperatura ambiente. Las pipetas de vidrio con una resistencia de pipeta de 3 a 10 MΩ se extrajeron de vidrio de borosilicato (Harvard Apparatus, EE. UU.). La solución interna contenía KCl 74 mM, K-gluconato 70 mM, EGTA 0,2 mM, MgATP 4 mM, HPEPS 10 mM y Na2-fosfocreatina 7 mM, ajustado a pH 7,3 con KOH. La solución de Tyrode extracelular contenía NaCl 125 mM, KCl 2 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HPEPS 25 mM y D-glucosa 51 mM, ajustada a pH 7,3 con NaOH. Después de la introducción y del registro de células completas, se midieron inmediatamente los potenciales de membrana en reposo de cada neurona. Las resistencias de sellado de la grabación fueron de 3 a 10 MΩ. Rheobase fue el paso actual mínimo de 1 s que podría desencadenar más de un potencial de acción. Las resistencias de entrada se registraron con un paso de corriente de −50 pA durante 1 s. Las resistencias de entrada se midieron a partir de la diferencia de voltaje entre la línea de base y los últimos 100 ms de aplicación de corriente.

Se preparó solución de Tyrode (NaCl 125 mM, KCl 2 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES 25 mM, D-glucosa 51 mM (Sigma-Aldrich)) para todas las imágenes de Ca2+ para células cultivadas. Se utilizó el kit de imágenes Fluo-4 Ca2+ (Invitrogen) para medir las respuestas de Ca2+ de las neuronas cultivadas. El protocolo para la formación de imágenes fluo-4 fue indicado por Invitrogen. Las neuronas se incubaron en la solución de Fluo-4 (1 mM) durante 15 a 30 minutos y luego se transfirieron a la solución de Tyrode sin Fluo-4 para obtener imágenes. Se agregaron 3,5 μl de nanodiscos de magnetita o nanodiscos de hematita a una concentración de 20 mg/mL a cada pocillo con 496,5 μL de solución en una placa de 24 pocillos. La concentración final de nanodiscos es de 70 μg/pozo. Después de 5 min de incubación, el cubreobjetos con la neurona del hipocampo se transfirió a un escenario personalizado para aplicar un campo magnético bajo un microscopio de fluorescencia (SS-1000-00, Scientifica). Se utilizó la fuente de luz Thorlabs (LEDD1B), la cámara Hamamatus C13440, el cubo de filtro GFP (39002, Chroma) para obtener imágenes fluo-4.

Los videos de actividad de Ca2+ se recolectaron en un microscopio de fluorescencia vertical (SS-1000-00, Scientifica) en formato ".avi" usando el software HCImage (Hamamatsu). La velocidad de fotogramas del video fue de 1 Hz. Los videos se procesaron con un script de python personalizado basado en opencv2. Se utilizó un script de Python personalizado basado en numpy para convertir la intensidad de fluorescencia en ΔF/F0 adaptando el algoritmo del estudio anterior11. El detalle del algoritmo y la secuencia de comandos de Python se describe en la información complementaria. La celda activada se definió por la celda con un máximo de ΔF/F0 superior al 10 % en los períodos de tiempo indicados. La tasa de actividad celular de cada muestra de cultivo se definió por el porcentaje del número de células activadas dividido por el número total de células. Para obtener más detalles sobre los scripts personalizados, consulte la información complementaria.

La solución de Tyrode sin Ca2+ (NaCl 125 mM, KCl 2 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 2,5 mM, HEPES 25 mM, D-glucosa 51 mM (Sigma-Aldrich)) se preparó para experimentos libres de Ca2+. El inhibidor de la familia TRPC SKF-96365 (Tocris) se añadió a la solución de Tyrode con Ca2+ a una concentración de 50 μΜ. El inhibidor específico de TRPV4 HC-067047 (Sigma) se añadió a la solución de Tyrode a una concentración de 1 μΜ. Se añadió el bloqueador de canales de sodio de tetrodotoxina (TTX) (Abcam) a la solución de Tyrode a una concentración de 100 nM. El inhibidor específico de TRPC 1/6 y piezo1 GsMTx4 (Abcam) se añadió a la solución de Tyrode a una concentración de 5 μΜ. El inhibidor específico de TRPC 1/6 y piezo2 D-GsMTx4 (Tocris) se añadió a la solución de Tyrode a una concentración de 5 μM. El inhibidor de TRP 2-APB (Tocris) se añadió a la solución de Tyrode a una concentración de 100 μΜ. En los experimentos de farmacología, las células cultivadas se transfirieron de la solución de Tyrode con Fluo-4 a las soluciones mencionadas anteriormente durante más de 5 minutos antes de obtener la imagen.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por NYCU IACUC, de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de NYCU. Todos los ratones se adquirieron de LASCO. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h en el Centro de animales de laboratorio de la NYCU antes de los experimentos. Se usaron ratones macho C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad en todos los experimentos in vivo. Nanodiscos de magnetita y hematita recubiertos con PMAO a 1 mg/ml se inyectaron unilateralmente en STN (AP: -2,06, ML: -1,5, DV: -4,5). Se inyectaron un total de 2 μl de nanodiscos en PBS utilizando una jeringa de microinyección (7803-05, Hamilton) y una microbomba (Kd Scientific). Después de la cirugía craneal, se administraron 0,2 ml de carprofeno (PHR1452, Sigma-Aldrich) a los ratones mediante inyección subcutánea a las 0, 24, 48 h para reducir el dolor posquirúrgico.

Para la tinción de c-fos, se colocaron ratones macho C57BL/6 inyectados con nanodiscos en una bobina hecha a medida para estimulación magnética in vivo de 5 a 7 días después de la inyección de nanodiscos. Los ratones se sacrificaron 90 min después de las estimulaciones magnéticas. Para la tinción de TRPC se utilizaron ratones macho C57BL/6 sin estimulación magnética. Para teñir los MND marcados con fluorescencia, se sacrificaron ratones macho C57BL/6 el mismo día o 5 días después de inyectar los MND marcados con fluorescencia en STN. Todos los cerebros se recogieron después de la perfusión transcraneal con PFA al 4% en PBS. Las secciones coronales del cerebro se cortaron con un vibratomo (5100 MZ, Campden) con una amplitud de 0,5, una frecuencia de 50 Hz. Los cortes para la inmunotinción tenían un grosor de 50 μm. Los cortes con MND marcados con fluorescencia tenían un grosor de 150 μm. Los cortes de cerebro se lavaron tres veces con PBS durante 5 min, los cortes se permeabilizaron con Triton X-100 al 2 % (v/v) (Sigma-Aldrich) durante 15 min. El fondo se aclaró con Triton-X-100 al 2 %, H2O2 al 30 % y metanol durante 10 min; Después de lavar los cortes con PBS tres veces, los cortes se bloquearon con suero de cabra normal al 3% en PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente. Los cortes se lavaron con PBS tres veces. Para la inmunotinción, los cortes se incubaron con la primera solución de anticuerpo con anticuerpo monoclonal anti-c-Fos de conejo 1:750 (9F6#2250, señalización celular), anticuerpo anti-NeuN de ratón 1:150 (clon A60, #MAB377, MERCK), 1 :200 anti-conejo NeuN (MABN140, Sigma-Aldrich), 1:100 anti-conejo TRPC1 (SI-T8276, Sigma-Aldrich), 1:500 anti-ratón TRPC5 (N67/15, NeuroMab), 1:100 anti- -TRPC6 de conejo (AB5574, MERCK), suero de cabra normal al 1% y Triton-X 100 al 2% en PBS. Los cortes se incubaron a 4 °C durante 16 a 18 h. Después de tres lavados de los cortes con PBS, los cortes se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente en PBS (1:500 cabras anti-conejo Alexa Fluor 488 (ab150113, Abcam) y 1:500 cabras anti-ratón Alexa Fluor 594 (ab150116, Abcam)). Todos los cortes se lavaron con PBS tres veces antes del montaje. Los cortes se montaron en portaobjetos de microscopio de vidrio mediante medio de montaje con DAPI (GTX30920, Genetex). Microscopio de fluorescencia invertido (DMI3000, Leica), microscopio de fluorescencia vertical (SS-1000-00, Scientifica), fuente de luz LED (pE300, CoolLED), cámara Hamamatsu C13440, cubos de filtro (39000, 19008, 31002, Chroma) para la obtención de imágenes .

La bobina era una bobina con núcleo de aire hecha con 2000 vueltas de alambre de cobre autoadhesivo de 18 AWG (SBWR, Chientai). La bobina tenía una resistencia de 7 Ω y una inductancia de 60 mH. A una estimulación de campo magnético variable de 1 Hz, se usaron de 0,6 A a 2,8 A para una estimulación de 10 a 50 mT. A una estimulación magnética de 5 Hz, se utilizaron de 0,6 A a 2,9 A para una estimulación de 10 a 50 mT. A una estimulación magnética de 10 Hz, se utilizaron de 0,6 A a 3 A para una estimulación de 10 a 50 mT. A una estimulación magnética de 20 Hz, se utilizaron de 0,7 A a 3,2 A para una estimulación de 10 a 50 mT. Se utilizó un controlador de puente H hecho a medida para generar campos magnéticos variables con bobina. El puente H estaba formado por dos MOSFET de canal p (IRF4905, International Rectifier) y dos MOSFET de canal n (IRF3710, International Rectifier). Además de estos cuatro MOSFET, se usaron dos MOSFET de canal n más para controlar los MOSFET de canal P que en el puente H. El rango de voltaje de trabajo está controlado por dos pares de resistencias y parámetros de MOSFET. El circuito se puede modificar fácilmente reemplazando diferentes resistencias o MOSFET. Se usó un generador de funciones (33210 A, Keysight) para generar ondas cuadradas de ± 5 V. La señal del generador de funciones pasó a través de un seguidor de voltaje y un inversor (TLC2272, Texas Instrument). Las ganancias del seguidor de tensión y del inversor son iguales a uno. Las fases de las señales del seguidor de tensión y del inversor tienen una diferencia de 180°. Cada señal controla un medio puente del controlador de puente completo. Se utilizó una fuente de alimentación interna (modelo PS-3030DF, LONGWEI) para amplificadores operacionales en el controlador de puente H personalizado. Se utilizó una fuente de alimentación externa (IT6721, ITECH) para generar campos magnéticos en la bobina.

Para evaluar los campos magnéticos generados por bobinas, utilizamos el software Finite Element Method Magnetics (versión 4.2) para simular campos magnéticos de bobina en 2D (Figs. 2d, 5c). En la configuración del programa, usamos el modo de problema magnético y la configuración plana en FEMM4.2. Los parámetros de alambre de cobre (12 o 18 AWG) y aire fueron de la biblioteca de materiales en FEMM4.2. Se utilizó un medidor de Gauss (TM801, KANETEC) para medir el campo magnético en la bobina. La sonda axial se utilizó para detectar el campo magnético que se generó dentro de la bobina.

La muerte de neuronas cultivadas primarias con múltiples estimulaciones magnetomecánicas se midió con yoduro de propidio (PI; P1304MP, Invitrogen). Después de obtener imágenes de las respuestas de Ca2+ de las neuronas cultivadas primarias con Fluo-4, se añadió PI a la solución extracelular para lograr una concentración final de 120 μM. Después de 5 minutos, se tomaron imágenes de la fluorescencia de Fluo-4 y PI utilizando un microscopio de fluorescencia (SS-1000-00, Scientifica). Se utilizaron la fuente de luz Thorlabs (LEDD1B), la cámara Hamamatus C13440 y los cubos de filtro (39002 y 39010, Chroma).

Generar un campo magnético uniforme para la estimulación neuronal inalámbrica in vivo. Se utilizaron cuatro bobinas de núcleo de aire hechas a medida para experimentos in vivo. Cada bobina tiene 500 vueltas de alambre de cobre de 12 AWG. La resistencia e inductancia de cada bobina es de 1,02 a 1,55 Ω y de 22 a 31,6 mH, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 6, cuatro bobinas se separan en dos pares que se apilan una sobre la otra. El espacio entre las bobinas es de 4 cm. Se utilizaron módulos de puente completo (AQMH3615NS, AKELC) como controladores para cada bobina. Los drivers fueron controlados por ondas cuadradas de 5 V generadas por Arduino UNO (Arduino). La placa Arduino estaba controlada por un script personalizado con Arduino IDE. El detalle del código Arduino se describió en la información complementaria. La fuente de alimentación interna es de 5 V y la proporciona Arduino para proporcionar voltaje de trabajo para módulos de puente completos. Se utilizó una fuente de alimentación externa (modelo HJS-1000, HuntKey) para suministrar las corrientes a las bobinas. Se utilizaron corrientes de 10 A para generar un campo magnético uniforme con 50 mT a 10 Hz en las bobinas para experimentos in vivo.

Todos los animales se habituaron a la sala de comportamiento durante al menos 45 minutos antes de la estimulación magnética. La arena del cilindro fue realizada en Polimetilmetacrilato de 20 cm de diámetro interior y 16 cm de altura, encajando dentro del aparato magnético hecho a la medida. Los ratones despiertos se colocaron en la arena del cilindro en el centro de la bobina y la cámara los registró desde arriba. Antes de la estimulación, hay 5 min de período de preestimulación sin aplicar campos magnéticos, seguidos de 10 min de período de estimulación magnética. En el período de estimulación magnética, se aplicaron 10 veces 30 s de estimulación por campo magnético alternativo (50 mT a 10 Hz) y 30 s de interestimulación sin campo magnético. Este proceso de estimulación magnética se utilizó para investigar la actividad neuronal con c-fos y para pruebas de comportamiento de rotación. El DeepLabCutTM (DLC)48 informado anteriormente se usó para rastrear ratones sin marcas en los videos de comportamiento grabados. Se utilizó un código python hecho a medida para analizar los comportamientos de rotación. Consulte los métodos complementarios para obtener una descripción detallada y secuencias de comandos.

Todas las estadísticas se realizaron en JASP (v0.14.1.0, equipo JASP). Todas las barras de error en los diagramas de puntos indican el error estándar de la media (sem). Todas las áreas grises o rosadas en los rastros de los cambios de fluorescencia indican el error estándar de la media (sem). Se utilizó la prueba de rango con signo de Wilcoxon para comparar datos pareados. Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar datos no apareados. Se utilizó la prueba post-hoc de Tukey y ANOVA de dos vías para comparar datos con dos factores. Se utilizaron la prueba post-hoc de Dunn y la prueba de Kruskal-Wallis para comparar datos con múltiples grupos. Los números de células individuales, muestras (cultivos individuales) y animales de cada experimento se indican en las leyendas de figuras y tablas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen subyacentes a las cifras utilizadas en el estudio actual se proporcionan en Datos complementarios 1. Todos los demás datos están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

El código relacionado con este estudio está disponible en la sección Métodos de la información complementaria.

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Agradecemos a P. Ankieeva, D. Gregurec y F. Koehler por sus consejos sobre materiales y electrónica. Esta investigación está financiada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST), Taiwán (ROC) (108-2636-B-009-006; 109-2636-B-009-008; 110-2636-B-A49-003).

Estos autores contribuyeron por igual: Chih-Lun Su, Chao-Chun Cheng.

Instituto de Ingeniería Biomédica, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Ciudad de Hsinchu, Taiwán, República de China

Chih-Lun Su, Chao-Chun Cheng, Ping-Hsiang Yen, Jun-Xuan Huang, Yen-Jing Ting y Po-Han Chiang

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Conceptualización: PHC, CLS Metodología: PHC, CLS, CCC, PHY, JXH Investigación: CLS, CCC, PHY, JXH, YJT Análisis formal: CLS, CCC, JXH, YJT Visualización: CLS, CCC, PHY, JXH, YJT, PHC Adquisición de fondos: PHC Administración del proyecto: PHC Supervisión: PHC Redacción: borrador original: PHC Redacción: revisión y edición: PHC, CLS, CCC, PHY, JXH, YJT

Correspondencia a Po-Han Chiang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Rahul Srinivasan y Xiaoming Jin por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Eliana Scemes y Gene Chong. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Su, CL., Cheng, CC., Yen, PH. et al. Neuromodulación inalámbrica in vitro e in vivo mediante estimulación magnetomecánica intrínseca mediada por TRPC. Commun Biol 5, 1166 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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Recibido: 14 febrero 2022

Aceptado: 17 de octubre de 2022

Publicado: 02 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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